RNA 干扰的成败，一半取决于序列，一半取决于递送。siRNA 只有 21~23 nt，自身无法穿过细胞膜，必须依靠脂质体等转染试剂把它送进细胞质。如果这一步出了问题，后面所有检测数据都无从谈起。本篇聚焦转染环节最常被问到的 3 个问题：能不能加血清、细胞状态差怎么办、能不能靠加浓度救效率。

坑一：配制脂质体—siRNA 复合物时加了血清

血清中含有大量蛋白质，其中带负电荷的蛋白会与阳离子脂质体发生竞争结合，干扰脂质体—siRNA 复合物的正常形成，直接导致转染效率下降。

更麻烦的是另一方面：脂质体在转染过程中可能把血清中的蛋白一并带入细胞，引发细胞毒性，使细胞状态变差，转染效率进一步降低。也就是说，血清带来的负面影响是双重的——既影响复合物形成，又影响细胞活性。

▎ 实操规则：不同转染试剂要求不同

以 Lipofectamine 2000 为例：配制 siRNA 与 Lipofectamine 2000 混合物时不能含有血清；而细胞培养基可以含有血清，但不能含有抗生素。不同品牌、不同代次的试剂要求并不一致，建议先完整阅读转染试剂说明书，再开始实验。

一句话记住：混合时无血清、无抗生素；培养时可有血清、无抗生素。

坑二：转染 siRNA 后细胞状态差

细胞状态差会同时污染 mRNA 和蛋白两个层面的数据——你看到的"敲低后差异"，很可能只是毒性造成的假象。可以从以下 3 个方向改善：

1. 转染试剂的细胞毒性

外源的化学刺激会在一定程度上影响细胞活力。应对办法是优化转染试剂的用量、优化转染时间（例如适当缩短复合物与细胞共孵育的时间），或者更换毒性更小的转染试剂。

2. 细胞自身的状态条件

选用代数较低的细胞，控制转染时的细胞密度，保证细胞在转染时处于比较好的状态。这属于实验的基本功，却也是最容易被忽略的一环。

3. 基因本身的功能特性

部分基因与细胞应激等生物学过程相关，其表达量对外界刺激非常敏感。这类基因被敲低后，细胞状态变差往往不是试剂的锅，而是靶基因本身的功能所致。此时可以适当调整检测时间、控制敲低效率（不必一味追求 90% 以上的敲低），在"有效敲低"和"细胞能活"之间取平衡。

坑三：把 siRNA 浓度加倍来提高沉默效率

当我们采用成熟的转染体系却依然没有获得理想的干扰效率时，第一选择应该是更换干扰序列，而不是先把浓度往上堆。如果确实要优化转染浓度，也应当在一定范围内进行，通常的优化范围是 10~150 nM，不宜过大。

▎ 为什么不建议盲目加量

高浓度的 siRNA 会增加非特异性作用的可能性，产生脱靶效应，并对细胞产生毒性——最终你得到的可能不是更高的敲低效率，而是一堆不可信的数据。另外要注意：转染试剂的浓度并不是严格与 siRNA 浓度线性相关的，建议在说明书指导下按梯度设置，而不是自行等比例放大。

小结一下本篇的决策顺序：先看转染体系是否规范（血清、抗生素、细胞状态）→ 再换序列 → 最后才在 10~150 nM 范围内微调浓度。

本篇要点速查