cDNA 克隆获得含 5'/3'UTR 的全长转录本，通常连入克隆载体，用作 PCR 模板、测序模板和基因功能研究，需再亚克隆才能表达蛋白；ORF 克隆只取 ATG 到终止密码子的编码区，连入 pCMV 等表达载体并含 Kozak 序列，可直接转染细胞表达蛋白。做蛋白表达选 ORF，要基因模板选 cDNA。

亚克隆是把已有质粒上的片段通过酶切或 PCR 切下后重新连入新载体，适合换载体、加标签、换启动子；PCR 克隆是从 cDNA、基因组 DNA 或质粒模板直接扩增目的片段后克隆，适合从样本中首次获取基因。基因已在现货库中时，亚克隆更快捷经济。

可以。需提供载体完整序列（建议已测序验证）、图谱或抗性/拷贝数信息，并说明期望插入位点；序列不全时可寄送质粒或甘油菌由我们测序验证。若用到特殊内切酶，可您提供或我们代购。没有合适载体时，可从 200+ 种免费载体库中选用。

我们采用同源重组（无缝克隆）技术，不依赖载体与片段的匹配酶切位点，可将片段插入任意载体的任意位置，一次反应完成定向克隆，无需多步酶切-连接，阳性率高，尤其适合酶切位点不匹配、大片段及多片段拼接。

常规序列（GC 正常、无复杂二级结构）单点突变成功率接近 100%，多点或复杂模板会先做评估并沟通方案，全部经 Sanger 测序验证后交付。一个突变单位指同一条引物覆盖范围（约 30 bp 窗口）内的任意碱基改变：单碱基替换、连续 3 bp 改一个密码子、插入 10 bp 标签、删除 20 bp 片段各计 1 处；两位点相距较远需两对引物则计 2 处。

常规克隆 <2 kb 约 1–7 个自然日，2–3 kb 约 7–12 天，3–4.5 kb 约 12–15 天，4.5–5 kb 约 15–20 天。单点突变 1–10 天，双点突变 10–25 天（视质粒大小），多处突变按位点数量与间距评估。难度序列或使用特殊载体/宿主时周期适当延长。

建议先做全质粒测序确认序列，再进行克隆或突变。模板本身若存在未知突变，会导致克隆或突变结果错误且难以排查。全质粒测序可交由我们一站式完成。

可以，属于难度项目。我们会根据 GC 含量、重复序列、二级结构等做专项评估并给出定制方案。大片段通常建议采用基因合成（无需模板，可同步密码子优化），或从 BAC/PAC 等大片段载体通过同源重组获取。