siRNA是化学合成的21-23nt双链RNA，直接转染细胞起效，作用快（24-72h）但瞬时（3-7天），适合短期实验和高通量筛选；shRNA是DNA载体表达的发夹RNA，经细胞内Dicer加工成siRNA起效，作用慢（48-96h）但可通过质粒稳定表达或病毒整合实现长期沉默，适合构建稳定敲低株。

短期可逆敲低选siRNA，长期稳定敲低选shRNA。

siRNA设计遵循多项原则：
(1)靶序列长度21-23nt，GC含量30-50%最佳；
(2)避开mRNA二级结构紧密区域，确保靶位点可及性；
(3)正义链3'端热力学稳定性低于反义链5'端（AUM原则），确保反义链优先装载RISC；
(4)避开SNP高频位点、重复序列；
(5)全基因组脱靶分析，排除seed序列（2-8位）与非靶标mRNA 3'UTR高度同源的候选。

三保一套餐由我们设计，采用经典设计逻辑+脱靶分析，确保3条中至少1条有效。

OPC（Oligonucleotide Purification Cartridge）是 cartridge纯化，去除短链失败产物和盐分，纯度约75%，成本较低，适合常规细胞转染实验；

HPLC（高效液相色谱）纯化纯度≥90%，去除失败产物更彻底，适合对纯度要求高的实验（如体内实验、敏感细胞转染、定量实验）。

常规细胞系（HEK293/HeLa）转染选OPC即可；原代细胞、干细胞、动物实验或需发表文献的数据建议选HPLC

siRNA转染后，RISC装载和mRNA降解在24-48小时内发生，mRNA水平敲低在48-72小时达峰；蛋白水平由于现有蛋白需降解，通常72-96小时达峰。敲低效果持续3-7天（因细胞分裂稀释siRNA），之后逐渐恢复。

如果需要更长时间敲低，可选择shRNA（稳定表达）或重复转染siRNA（每3-4天补加）。

siRNA转染效率直接影响敲低效果，建议：
(1)使用Cy3/FAM荧光标记siRNA（或套餐中的Cy3标记阴性对照）监控转染效率，目标>80%；
(2)优化转染试剂（可适用质因生物ZY FectEasy RNA转染试剂）和比例；
(3)细胞状态需良好（对数生长期、低代次、无支原体污染）；
(4)siRNA工作浓度通常10-50nM，过高增加脱靶风险；
(5)敏感细胞（原代、干细胞）可考虑电转染或病毒递送。

三保一套餐含Cy3标记对照，方便监控转染效率。

阴性对照（Negative Control, NC）：与靶基因无关的siRNA序列，不靶向任何基因。作用是验证敲低表型的特异性——如果NC也有表型变化，说明是非特异效应（脱靶或转染毒性）。Cy3标记NC额外可监控转染效率。

阳性对照（Positive Control, PC）：靶向管家基因（如GAPDH/ACTB）的siRNA，已知有效。作用是验证整个实验体系（转染试剂、细胞状态、检测方法）是否正常——如果PC都敲低失败，说明实验体系有问题，需排查转染条件而非靶序列。