推荐 15–25 bp，Tm 值 ≥48℃（按 A-T=2℃、G-C=4℃ 估算）。过短会降低重组效率，过长可能影响 PCR 扩增特异性。引物 3' 端避免出现 3 个以上连续相同碱基，前后引物 Tm 差异控制在 2℃ 以内，可用 SnapGene、Benchling 或 NEBuilder 辅助设计。

① 检查载体是否线性化完全：加大酶量、延长酶切时间并做胶回收；② 单酶切载体建议做去磷酸化处理；③ 确认平板抗生素有效，使用新制备的抗性平板；④ 插入片段与载体摩尔比控制在 2:1–3:1（片段 <200 bp 时 ≥5:1），DNA 纯度建议 A260/A280 = 1.6–1.9、A260/A230 ≈ 2。

多为 PCR 扩增出非特异条带，或载体 / 片段含同源重复序列导致重组紊乱。建议对 PCR 产物做胶回收纯化、优化扩增条件，并重新挑取多个菌落提质粒验证，同时设置阴性对照排除假阳性。

确认洗涤液已按瓶身标注加入无水乙醇；溶胶液若变为橙红 / 粉红色（pH>7.5），加 10 μL 3 M NaAc（pH 5.0）调回浅橙黄色；使用新配 TAE / TBE；长片段（10–15 kb）适当增加上样量、洗脱体积加至 50 μL 并 65℃ 预热洗脱。

多为乙醇残留所致：漂洗后务必空柱 12,000 rpm 离心 1 min，并开盖室温放置 5–10 min 彻底挥发乙醇。若电泳呈弥散带，可能含单链 DNA，95℃ 加热 1 min 后缓慢冷却复性即可。洗脱时使用pH 8.0–8.5 的低盐洗脱液并加在膜中央充分浸润。

得率低：使用新鲜菌液、确认抗生素有效，低拷贝质粒增加菌液量（小量可至 4–6 mL，中量可至 10 mL），洗脱体积不低于 50 μL（小量）/ 100 μL（中量），洗脱液 65℃ 预热可提高得率。RNA 污染：确认 RNase A 已全部加入 Solution I，存放超过 3 个月需补加新鲜 RNase A，或减少起始菌量。

多为菌体量过多导致裂解不充分，可减少菌液量或分两管处理；也可能是 Solution I 重悬不充分（需充分悬浮、避免残留菌块）或存在外源杂菌污染。

1 kb-IV（13 条带，250 bp–12 kb）适合大片段与长片段载体验证；100 bp-II plus（11 条带，100 bp–1500 bp）适合小片段精确判读与 Indel 检测；250 bp-I（6 条带，100 bp–2000 bp）适合 PCR 与酶切产物快速判读；250 bp-II（9 条带，100 bp–5000 bp）适合中等插入片段的克隆筛选。